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為什么你的色譜柱柱效總是測不好

更新時間:2022-10-26點擊次數:1705

色譜從1903年開創至今,已經120年,是重要的一門科學,在制藥,食品、環境、能源等領域都有非常廣泛的應用,可以肯定的是未來分析測試進步依然離不開色譜。


由于中國在色譜發展起步時間晚,作為從業人員的你是不是也經常碰到這樣的困惑:



開發方法中,如何進行色譜柱的選擇?

色譜柱如何沖洗維護,增加使用壽命?

SPE小柱前處理的開發流程?

為什么這次購買的色譜柱壞的這么快?

樣品瓶是否可以重復使用?

………


可以理解大家碰到的實際應用問題是很多的,但卻苦于書本上的經驗太少,也沒有太多可以咨詢的通道,遇到問題僅僅只能請教身邊的同事或同學,真正問題得不到系統性的解決,這嚴重阻礙了中國色譜的發展。


色譜圈匯聚各行業經驗達人、各大廠商工程師、自建的技術支持團隊為廣大分析人員提供免費、高效、有趣的技術咨詢平臺。


色譜問題,色譜圈幫你解答!


這一期,我們來討論柱效,即理論塔板數。


那什么是理論塔板數?

理論塔板數是基于經典的塔板理論,理論很不好理解,

我們可以用圖片上藍色和紅色區域的小橫線來表示,實際上這些橫線是不存在色譜柱里面的,橫線數量越多,表示柱效越高。

一般認為不同物質在柱里分離效果越好,代表柱子越好,在同類型柱子,分離效果(Rs)只與柱子的理論塔板數(n)有關,n越大,分離效果越好。

所以,為了增加Rs,我們需要追求高柱效。


根據n=L(柱長)/H(理論塔板數高度)可以得出,柱長越長,分離效果越好,例如: J&W DB-5ht 30m(柱長)*0.25mm(內徑),0.1μm(顆粒半徑)的柱子就會比 J&W DB-5ht 15m*0.25mm,0.1μm的要高,但柱長會增加會導致壓力增大,分析時間增加,峰寬增大,所以一味追求柱長不可取,因此降低理論塔板高度也是可行方式。

根據范第姆特方程,H=A+B/u+C*u

流速對理論塔板高度的影響

u為流動相流速,可見流速對理論塔板高度是兩方面的,B項是反函數,而C項是一次函數,因此,在較高流速范圍內降低流速對C項影響較大,對B項影響較小。此外,流速還會影響壓力,分析時間,峰寬等,所以選取適當降低流動相流速可提高柱效。

填料粒徑會影響范第姆特方程中AC項,簡單來說,填料粒徑越小,A,C兩項越小,柱效越高,例如:Xbridge C18 4.6*250mm 3um的柱子就會比Xbridge C18 4.6*150mm 5um的要高,但填料粒徑受制作工藝技術所制約。

柱溫對柱效的影響

柱溫對B,C兩項都有影響,溫度越高,簡單來說B項越高而C項越低,但對C項影響更大,因此提高柱溫能提高柱效,但柱子跟儀器有一定受熱范圍,過高的溫度可能會導致填料變性,測試物質變性等。


除此之外,填料顆粒結構,流動相粘度,填料厚度都會有影響。


總的來說:

提高柱效方法有:

1,減少填料粒徑

2,選用低粘度溶劑做流動相

3,適當范圍內降低流速

4,減少填料空穴深度

5,適當范圍內提高柱溫

6,增加柱長等


那我們如何測試柱子的柱效呢?

柱子包裝內會有柱子的COA(Certificate of analysis),如圖所示,COA內會給定實驗條件與測試物質,以及測試后得到的塔板數,分離度,不對稱因子等,在用COA上實驗條件測試得到數據后與或以前的數據做比較。

定期做柱效測試,便于追蹤色譜柱的性能變化。


然而,有經驗的分析人員會發現實驗室測的柱效會比COA報告的低!!

儀器型號:島津LC-2010-CHT


image.png

儀器型號:Waters 2695

那么為什么實驗室測的柱效會比COA報告的低?

其實主要原因來源如下:

1, 實驗室測試條件與COA報告要求不一致;

2, 儀器不同,管線內徑越大,擴散體積越大,柱外效應大;

3, 儀器檢測器采樣頻率設置過低,影響峰型;

4, 最容易忽略的是,進樣量(進樣濃度*進樣體積)過大,導致峰超載;

5, 色譜柱在不正確的機器上使用,例如:UPLC柱在普通HPLC上測柱效。


其實柱效的因素還有很多,歡迎大家提出。

請注意:色譜柱廠家測試COA數據所使用的色譜系統是專門設計的,其系統擴散體積非常低,測試出柱效為理想情況下,而實驗室儀器的管路連接,操作環境,系統電路,所使用溶劑質量都會不同,因此多數廠商默認﹐只要對應峰的柱效結果達到COA報告的70%或以

上均認為色譜柱沒有質量問題。

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